芽孢杆菌属的分类与鉴别

第一、芽孢杆菌属的分类

一、芽孢杆菌属微生物特性

    芽孢杆菌属，革兰氏阳性菌，需氧或兼性厌氧，产生芽孢，大多数无荚膜，以周生鞭毛运动。细胞呈直杆状，常以成对或链状排列，具圆端或方端。由于芽孢杆菌属的微生物能够形成芽孢的特性使得他们能够抵抗各种极端环境如高温、极酸、极盐，而且对各种杀菌剂具有抵抗力，因此，他们在各种自然环境中都能被分离到。芽孢杆菌属微生物具有共同的特性，都能够形成带有芽孢的生物膜，且代谢产物相似，都能产生环肽、抗生素、酸（多聚谷氨酸、聚天冬氨酸）和聚多糖等。

二、芽孢杆菌的分类方法

    分类学是研究生物分类的原理、方法和实践的科学，包括分类、命名、描述和鉴定等内容。目前细菌分类主要是采取多项分类技术。多项分类的概念是Colwell于1968年提出的，原理是利用微生物多种不同的信息，包括表型、基因型和系统发育的信息，综合起来研究微生物分类和系统进化的过程。概括的讲，多项分类是传统的表型分类、数值分类和分子分类等方法的综合应用，因而可以更客观地反映生物间的系统进化关系。目前，多项分类法被认为是研究各级分类最有效的手段，可用于所有水平上分类单位的描述和定义。

2、1经典分类（表型特征）

表型是由于基因和环境因素相互作用引起的，在细胞、器官和整体水平上能检测和观察到的特征。一般，原核生物的表型特征能区分不同菌种但不能区分菌株。表型特征包括形态学特征、生理生化特征、抗生素的敏感性、噬菌体分型、血清学分析。表型特征虽然不能说明物种之间的亲缘关系，但它却是人们认识微生物实际重要性和研究生物进化的基础，仍然是分类研究的基础。

芽孢杆菌，菌体杆状，直或近直，0.3~2.2×2.1~7.0um,多数运动，鞭毛典型侧生，形成抗热内生孢子，严格好氧或兼性厌氧。由于实验条件的限制，传统芽孢杆菌的分类主要是根据形态学特征即好氧或厌氧和有无芽孢形成。Gibson和Gorden依据芽孢的形状（卵形或球形）以及它们在菌体或芽孢囊中的位置，提出芽孢形态群体概念，将芽孢杆菌分为三个类群。由于这个种的分离方法是以群体来划分的，它对芽孢杆菌分类鉴定有着非常重要的作用。

群1、孢囊不显著膨大，芽孢椭圆或柱形，中生到端生，革兰氏阳性

A、生长在葡萄糖洋菜上的淡染细胞的原生质中有不着色的球状体

   1、严格好氧；不产生乙酰甲基甲醇................................................巨大芽孢杆菌

   2、兼性厌氧；产生乙酰甲基甲醇....................................................蜡状芽孢杆菌

B、生长在葡萄糖洋菜上的淡染细胞的原生质中没有不着色的球状体

   1、7%氧化钠中生长；石蕊牛奶不产酸

     a、在pH5.7生长；产生乙酰甲基甲醇

       （1）水解淀粉；硝酸盐还原到亚硝酸盐

           ①兼性厌氧；利用丙二酸盐..............................................地衣芽孢杆菌

           ②好氧；不利用丙二酸盐..................................................枯草芽孢杆菌

       （2）不水解淀粉；硝酸盐不还原到亚硝酸盐........................短小芽孢杆菌

     b、在pH5.7不生长；不产生乙酰甲基甲醇................................坚强芽孢杆菌

   2、7%氯化钠中生长；石蕊牛奶产酸...............................................凝结芽孢杆菌

群2、椭圆形芽孢使孢囊膨大，芽孢中生到端生，革兰氏阳性、阴性或可变

A、从碳水化合物产气

   1、产生乙酰甲基甲醇；从甘油形成二羟基丙酮............................多粘芽孢杆菌

   2、不产生乙酰甲基甲醇；不形成二羟基丙酮................................浸麻芽孢杆菌

B、不从碳水化合物产气

   1、水解淀粉

      a、不形成吲哚

        （1）65℃不生长............................................................................环状芽孢杆菌

        （2）65℃生长......................................................................嗜热脂肪酸芽孢杆菌

      b、形成吲哚..................................................................................蜂房芽孢杆菌

   2、不水解淀粉

      a、接触酶阳性；连续转解在营养肉汤中存活         

        （1）兼性厌氧；葡萄糖培养液中培养物的pH小于8.0.........侧孢芽孢杆菌

        （2）好氧；葡萄糖培养液中培养物的pH为8.0以上...............短芽孢杆菌

      b、接触酶阴性；连续转解不能在营养肉汤中存活

        （1）硝酸盐还原到亚硝酸盐；分解酪朊...................................幼虫芽孢杆菌

        （2）硝酸盐不还原到亚硝酸盐；不分解酪朊

             ①孢囊含有伴孢体；2%氯化钠中生长...........................日本甲虫芽孢杆菌

             ②孢囊不含伴孢体；2%氯化钠中生长............................缓病芽孢杆菌

群3、包囊膨大；芽孢通常球形，端生到亚端生；革兰氏阳性、阴性或可变

   不水解淀粉；生长不需要脲素或碱性pH...........................................球形芽孢杆菌

2、2分子分类法

《伯杰氏系统细菌学手册》指出：（1）DNA-DNA同源性在60%以上通常认为是同一种；（2）同源性在20-60%之间认为是同一属中的不同菌种；（3）同源性在20%以下的应考虑是不同属的菌种。随着技术的发展，芽孢杆菌的分类逐渐由传统的表型分类转化为分子分类，如G+C mol%、DNA重组试验、DNA-DNA杂交、PCR技术、16s rDNA序列测序等等。

G+C mol%分析：DNA含有A、G、C、T四种碱基，一般生物个体的DNA分子中（G+C）/(A+T)的比例是非常稳定的。G+C mol%的测定常用于验证已建立的分类关系是否正确，是细菌分类鉴定的基本方法，并作为描述细菌分类单位的特征之一。测定方法有熔点法（Tm值法）、浮力密度法、高效液相色谱法等。通常认为，种内菌株间G+C mol%相差不超过4%，属内菌株间的差异不超过10%。对芽孢杆菌的G+C mol%变化大约在33~65%,说明种还可以划分为几个遗传同源性的种类。

DNA-DNA杂交；DNA同源性分析是确定正确的分类单位，建立自然分类系统的最直接方法，而DNA-DNA杂交是分析DNA同源性的一种有效手段。利用DNA杂交可以在总体水平上研究菌株之间的关系，用于种水平上的分类研究。1987年国际系统细菌委员会规定：DNA同源性≥60%为细菌种的界限，DNA同源性≥70%是同一亚种，同源性在20~60%之间为同属不同种。在细菌分类中DNA杂交已被确定为建立新种的必要标准之一。常用的方法有液相复性速率、固相膜杂交法、羟基磷灰石吸附法、S1核酸酶法等。

由于16S rDNA基因序列的保守性和存在的普遍性，应用16S rRNA作为分子指标已逐渐成为微生物检测和分类鉴定的一种强有力工具。Masataka Satomi等从宇宙飞船设备上得到一些分离物，经试验分离证明是一种细菌，16S rRNA序列系统发育分析表明是属于芽孢杆菌属，与Bacillus pumilus(短小芽孢杆菌)很相近但又有很多表型不同的地方，DNA-DNA、rep-PCR表明是芽孢杆菌的一个新种，命名为Bacillus safensis。根据16S rRNA序列系统发育分析、DNA-DNA杂交，Cheok Jeon等将Bacillus haloalkaliphilus 从芽孢杆菌属中分离出一个新属Alkalibacillus, Bacillus haloalkaliphilus命名为Alkalibacillus haloalkaliphilus。Ibrahim M Banat等对Bacillus pallidus进行16S rRNA测序构建系统发育树，分析得出Bacillus pallidus与芽孢杆菌属有很大的区别而和Geobacillus很相近，故将它归入Geobacillus属。所以利用分子技术可以根据菌的基因进行鉴定，提高芽孢杆菌的分类地位划分的更准确。微生物的分类地位进行初步判断流程如下：

目的菌总DNA的提取 → 16S rRNA的PCR → 16S rRNA序列测定 → 与Genbank中已知序列进行Blast比对 → 找出相似性最高的序列 → 将所得序列排序比 → 用建树软件建树状图 → 判定目的菌的分类地位或系统发育地位

2、3化学分类

以微生物化学组成成分为指标进行微生物分类研究的学科称为微生物的化学分类学。化学分类技术是检验微生物的某些化学成分而不是其生物学特征，微生物中含有一些化学物质，其含量或结构具有种属特征或与其分类地位密切相关，能够标志某一类或某几种微生物的存在，称为生物标志物。这些具有分类学意义的化学物质的存在状态可以作为鉴定微生物的标志。很多仪器分析手段如高效液相色谱、气相色谱、气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用等，逐渐在微生物分类和鉴定中显示出强大的功能。

脂肪酸分析   细菌细胞内的脂肪酸易于提取和分离，经过甲酯化后挥发性大大改善，稳定性好，很适合于气相色谱分析。在细菌分类学中，气相色谱是分析细菌脂肪酸成分的主要工具。脂肪酸是细菌细胞中一种含量较高的、相对较稳定的化学组分，只要存在于细胞膜等生物膜脂双分子层以及游离的糖脂、磷脂、脂蛋白等生物大分子中。已有的研究结果表明，各种细菌中存在300多种脂肪酸及脂肪酸衍生物。种类不同的细菌含有的脂肪酸的种类和含量有一定的差别，人们可以根据脂肪酸的不同含量对未知菌株进行鉴定命名。脂肪酸对于不同生物油不同的成分特征，是细菌分类的重要指标和依据。目前，脂肪酸成分分析已成为芽孢杆菌分类鉴定的一种新手段，通过脂肪酸成分分析可以将未知菌快速鉴定到种属。宋亚军等人对若干需氧芽胞杆菌的芽孢脂肪酸成分进行了系统分析，并探讨了其在分类学上的意义，为需氧芽胞杆菌的分类研究提供了新的资料。

醌组分分析   细菌细胞膜上的醌有泛醌（辅酶Q）和甲基萘醌（MK）。甲基萘醌的侧链由不同的异戊烯单位构成，根据侧链长度和双键氢化的程度可分为多种类型。不同类型由甲基萘醌的有无与含量是属和种鉴定中的一个重要指标。

磷酸类脂分析   磷酸类脂是一种极性脂类，是构成细胞膜的重要成分。研究表明具有分类学意义的磷酸类脂为磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰甲基乙醇胺、磷脂酰甘油、含葡萄糖未知结构的磷酸类脂等。

全细胞蛋白SDS-PAGE分析   全细胞蛋白SDS-PAGE是一种通过分析蛋白电泳图谱来获取分类信息的技术。在高度标准化的培养条件下它是一种分群和大量比较相近菌株的较好方法。该方法的一个优点是它与DNA杂交分析结果有很好的相关性，适用与种的水平上的区别。

第二、芽孢杆菌的分离、保存与鉴定

一、微生物分类鉴定主要是采用多相分类法，综合表型特征、化学特征、分子测序等方法。本次运用生理生化特征、脂肪酸鉴定等方法对分离的芽孢杆菌菌株进行鉴定，并对脂肪酸鉴定和ITS测序两种鉴定方法进行了比较。

二、方法

2、1芽孢杆菌的分离方法

采用稀释涂布法从土壤中分离芽孢杆菌，实验方法操作参照钱存柔、黄仪秀编著的《微生物学实验教程》。具体方法如下：

①称样   称取10g土壤至装有90mL无菌水的三角瓶，振荡15min，使之充分溶解，即配成10^（-1）浓度；②稀释 吸取1mL原液至装有9mL无菌水的试管，即配成10^（-2）浓度，再次稀释成10^（-3）；③水浴   将稀释好的土样溶液放在80℃水浴锅水浴10min，期间振荡2-3次；④涂布   超净台上无菌操作，溶液在振荡器上振荡10-20s，吸取100uL至相应标记浓度的平板上，溶液滴至平板中央，涂布棒涂匀。每个梯度重复3次；⑤培养   将涂好的平板用倒置于30℃恒温箱中培养1-2d；⑥划线分离 选取要纯化分离的芽孢杆菌菌株并编号，纯化后30℃培养箱中培养；⑦结果计算   每克土样中芽孢杆菌的数量=同一稀释度的3个平板上菌落平均数×稀释倍数/含菌样品克数。

2、2 芽孢杆菌的保存

采用甘油冷冻保存和穿刺保存法，甘油冷冻保存菌株放于-80℃超低温冰箱，穿刺保存放于室温。

2、3 芽孢杆菌的鉴定

2、3、1芽孢杆菌的生理生化鉴定

    试验方法是参照东秀珠等编的《常见细菌系统鉴定手册》。

生理特性   ①温度梯度培养 测定温度（℃）有5,10,15,30,37,50,55，采用连续划线法取幼龄菌种划线培养，设3个重复，2d后观察结果。pH梯度有4.5， 5.7， 7.2， 8.0， 9.5，取幼龄菌种划线接种，设3个重复，2d后观察结果。耐盐NA培养基中加入不同浓度的NaCl（2%、5%、7%、10%），取幼龄菌种接种培养，设3个重复，培养3和7d，目测生长情况。②丙二酸利用   培养基为酵母膏1.0g，（NH4）SO4 2.0g，K2HPO4 0.6g，NaCl 2.0g，丙二酸钠3.0g，溴百里酚蓝0.025g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.4，分装试管，121℃灭菌15min,同时有不加丙二酸的空白对照。用幼龄菌接种，设3个重复，适温培养1-2d，培养基由绿变蓝者为阳性；培养基不变色者为阴性。③柠檬酸盐利用   培养基为NaCl 1g，MgSO4.7H2O 0.2g（NH4)2H2PO4 0.5g，柠檬酸钠2g，0.04%酚红液20mL，蒸馏水1000mL，pH7.0分装试管，121℃高压灭菌15min。斜面上划线接种，适温培养3-7d，培养基为碱性（指示剂蓝色或桃红色）者为阳性，否则为阴性。

生化特性   ①接触酶 将24h培养的菌种，以铂丝接种环取一小环涂抹于已滴有5%过氧化氢的玻片上，如有气泡产生为阳性，否则为阴性。②氧化酶 在干净培养皿里放一张滤纸，滴上四甲基对苯二胺的1%溶液，刮取菌苔涂抹在滤纸上，菌苔10s蓝色为阳性，10-60s变蓝为延迟反应，60s后为阴性反应。

葡萄糖氧化发酵   培养基为蛋白胨2g，NaCl 5g，K2HPO4 0.2g，葡萄糖10.0g，琼脂6.0g，溴百里酚蓝1%水溶液3mL，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2,121℃蒸汽灭菌20min。以18-24h幼龄菌种做种子，穿刺接种，每株4支。其中两支用灭菌的凡士林石蜡油（熔化的2/3凡士林中加入1/3液体石蜡，高压灭菌）封盖，约0.5-1cm厚，以隔绝空气为闭管。另2支不封油为开管，同时还要有不接种的闭管和开管作对照。适温培养1，2，7，14d观察结果。只有开管产酸变黄者为氧化型；开管和闭管均产酸变黄者为发酵型。

淀粉水解   NA培养基（牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，pH7.2），0.2%可溶性淀粉，取新鲜培养物点中于在肉汁胨中加入0.2%可溶性淀粉平板，适温培养。培养2-5d后观察形成明显菌落后，在平板上滴加碘液平板呈蓝黑色，菌落周围如有不变色的透明圈，表示淀粉水解阳性，仍是蓝黑色为阴性。

M.R反应   培养基为蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，水1000mL，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min。试剂为甲基红（甲基红0.1g，95%乙醇300mL，蒸馏水200mL）。接种实验菌于上述培养基中，每次3个重复，置适温培养2d，6d观察结果。在培养液中加入一滴甲基红试剂，红色为甲基红阳性反应，黄色为阴性反应。（甲基红变色范围是4.4红至6.0黄）。

V-P反应   培养基为蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，水1000mL，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min。试剂为肌酸0.3%或原粉，NaOH 40%。接种实验菌于上述培养液中，每次3个重复，置适温培养2d，6d观察结果。取培养液和40%氢氧化钠等量混合，加少许肌酸，10min后培养液若出现红色，即为阳性反应，否则为阴性。有时需要放置更长时间才出现红色反应。

硝酸还原反应   培养基为肉汁胨培养基牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，蒸馏水1000mL，KNO3 1g，pH 7.0-7.6，121℃蒸汽灭菌15min。A液：对氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸（10%）150mL；B液：α-萘胺 0.1g，蒸馏水20mL，稀醋酸（10%）150mL；二苯胺试剂：二苯胺0.5g溶于100mL浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释。将测定菌接种于硝酸盐液体培养基中，置适温培养1，3，5d，每株菌作2个重复，另留两管不接种作对照。取两支干净的空试管或在比色瓷盘小窝中倒入少许培养1，3，5d的培养液，再各加一滴A液和B液，在对照管中加入同样A液及B液一滴；当培养液中滴入A、B液后，溶液如变粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色等表示亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，则可加一、二滴二苯胺试剂，此时如呈蓝色反应，则表示培养液中仍有硝酸盐，又无亚硝酸盐反应，表示无硝酸盐还原反应；如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已还原成其他物质，按硝酸盐还原阳性处理。

吲哚反应   培养基为1%胰胨水溶液；pH7.2-7.6，分装试管，121℃灭菌20min。试剂为对二甲基氨基苯甲醛8g，乙醇760mL，浓HCl 160mL。把新鲜的菌种接种于上述培养基中，适温培养。培养1，2，4，7d后，沿管壁缓缓加入3-5mm高的试剂于培养液表面，在液层界面发生红色，即为阳性反应。若颜色不明显，可加入4-5滴乙醚至培养液，摇动，使乙醚分散于液体中，将培养液静置片刻，待乙醚浮于液面后再加吲哚试剂。

     明胶液化   培养基为蛋白胨5g，明胶100g，水1000mL，pH7.2-7.4，分装试管，121℃灭菌15min。取24h的培养菌穿刺接种，并有2支空白对照。30℃培养箱中培养2d后放在冰箱中，7，10，14，30d后观察是否液化。

2、3、2 芽孢杆菌的脂肪酸鉴定

脂肪酸提取方法主要是参照MIDI操作手册，具体如下：①获菌   挑取约40mg菌苔放入一个干净、干燥13mm×100mm有螺旋盖的试管中。②皂化   加入1.0±0.1mL的试剂1，拧紧盖子，振荡试管5-10s，沸水浴5min，取出振荡5-10s，拧紧盖子，继续水浴25min，试管移至室温冷却。③甲基化 加入2.0±0.1mL的试剂2，拧紧盖子振荡5-10s，精确控制（80±1）℃水浴10min，移开且快速用自来水冷却至室温。④萃取 加入1.25±0.1mL的试剂3，拧紧盖子，快速振荡10min，打开管盖，利用干净的移液管取出每个样本的下层似水部位。⑤基本洗涤 加入3.0±0.2mL的试剂4，拧紧盖子，快速振荡5min，取出约2/3体积的上层有机体到干净的GC小瓶。⑥上样，鉴定。

3、讨论

3、1芽孢杆菌的生理生化鉴定

细菌的生理生化性状具有可变性，使用不同的化学药品得出的鉴定结果可能会有一些的差异。所以很难用常规的生理生化指标将细菌鉴定到种。一般，生理生化指标只作为鉴定的辅助手段，描述微生物的一些基本特征。

3、2芽孢杆菌的脂肪酸鉴定

MIS是一套由美国MIDI公司开发成功的微生物鉴定自动化系统，该系统操作简单、安全、快速，实验成本也相对较低。它主要根据不同种类微生物细胞膜中磷脂脂肪酸的类型和含量具有种的特异性、指示性和遗传稳定性等特殊性能对微生物进行全自动鉴定和分析，该系统备有图谱识别软件和迄今为止微生物鉴定系统中最大的数据库资源，包括嗜氧菌1100余种，厌氧菌800余种，酵母菌和放线菌约300种，共计超过2200种。

刘志辉等应用气相色谱技术分析全细胞脂肪酸进行分枝杆菌菌种鉴定，和传统鉴定方法结果具有良好的一致性。脂肪酸的鉴定和16S rRNA 的序列相似性分析对微生物分类鉴定有着同等重要地位，每种菌特征脂肪酸的种类和含量不同，根据特征脂肪酸可以将未知菌快速鉴定到种或属。

三、芽孢杆菌鉴定方法的比较

     微生物种类繁多，以形态学和生理生化指标为基础的细菌鉴定较为复杂，而且是一项繁琐、费时的工作，对一种未知细菌的鉴定和分类，不仅需要分析多个生化指标，有时还要取决于工作人员的经验。近几年，随着核酸测序技术的普及和测序周期缩短、成本降低，细菌核酸序列数据库的不断充实，16S rDNA全序列和16S-23S rDNA间的内源转录间隔区序列测定已成为细菌的快速鉴定方法。但分子方法操作比较复杂，成本高且局限于典型性已鉴定的菌株。因此迫切需要建立一些简单、方便、易于操作的分类鉴定方法对微生物进行分析，使人们在一定程度上更科学、更精确、更快速地找到分离物的分类地位。

现代微生物学研究表明，细菌的细胞结构中普遍含有的脂肪酸成分与细菌的DNA具有高度的同源性，不同种属的细菌脂肪酸的组成和含量表现出不同程度的差异，并且这种差异是比较稳定的，根据脂肪酸成分可以将未知菌株快速鉴定到种或属。

三、芽孢杆菌的生态分布及多样性

一、芽孢杆菌的形态特征

   芽孢杆菌的形态特征包括细胞形态和菌落形态特征。芽孢杆菌细胞为杆状，直或近直，长生芽孢。如图描述了3种芽孢杆菌的细胞形态，a-d为简单芽孢杆菌的细胞形态：a为没有形成芽孢时的细胞形态，b-d为产生芽孢后的形态，从图中可以看出简单芽孢杆菌的芽孢中生，柱形或椭圆形。图片e为类芽孢杆菌的细胞形态：细胞小，短杆状，芽孢中生，近卵圆形。f为枯草芽孢杆菌的细胞形态：细胞长杆状，芽孢中生，柱状。

芽孢杆菌菌落形态根据种不同而不同，以下描述了几种常见芽孢杆菌的菌落形态：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)白色或浊白色，扁平，干燥，无光泽，表面的层膜状物形成褶皱，有的菌落中间有“水珠”，还有一株芽孢杆菌的菌落形态和其他完全不同，浅黄色，突起，近圆形，光泽，湿润。巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)黄色，湿润，光滑，不透明，粗壮，具有流动性，有的菌落表面微皱，菌落培养久时会产生黑色色素。蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)白色，扁平，圆形，边缘不整齐，有的布满整个平板，和覃状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)的菌落相似。球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus)浅黄色，圆形，有光泽，不透明，有时连成一片布满整个平板。多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)菌落小，米粒状，粘，紧贴培养基，不易挑取。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)黄色，湿润，边缘不整齐，突起。

二、芽孢杆菌的生态分布

2、1我国芽孢杆菌的种群数量

从表9中可以看出，巨大芽孢杆菌和简单芽孢杆菌在每个样点都能分离到，除青海外，每个样点都能分离到蜡状芽孢杆菌。15个采样点分离出12个芽孢杆菌种群，每个样点之间芽孢杆菌种群数量差异很大。每个采样点数量最多的芽孢杆菌菌种群分别为：吉林采样点的是巨大芽孢杆菌干土，新疆的为蜡状芽孢杆菌干土，内蒙古的为蜡状芽孢杆菌，甘肃的为巨大芽孢杆菌干土，宁夏的为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）干土，青海的为巨大芽孢杆菌干土，西藏的为简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)干土，陕西的为简单芽孢杆菌干土，山东的为巨大芽孢杆菌干土，上海的为蜡状芽孢杆菌干土，江西的为蜡状芽孢杆菌干土，四川的为蜡状芽孢杆菌干土，广东的为短小芽孢杆菌干土，云南的为为蜡状芽孢杆菌干土，海南的为巨大芽孢杆菌干土。

    根据优势种群的划分标准，某个物种占整体的百分比≥10%为优势种，1-10%之间为常见种，≤1为少见种。从表10可以看出，吉林采样点的优势种群为巨大芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌，常见种群为多粘类芽孢杆菌，少见种为蜡状芽孢杆菌和球形芽孢杆菌；新疆的优势种群为枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌黑色变种(Bacillus atrophaeus)，常见种群为巨大芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，少见种为苏云金芽孢杆菌；

内蒙古优势种群为蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌，常见种群为球形芽孢杆菌，少见种为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌黑色变种、多粘类芽孢杆菌；甘肃的优势种群为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌黑色变种，常见种群为简单芽孢杆菌；青海的优势种群为巨大芽孢杆菌和简单芽孢杆菌；西藏的优势种群为简单芽孢杆菌，常见种群为蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌；陕西的优势种群为简单芽孢杆菌，常见种群为蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌黑色变种，山东的优势种群为巨大芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌，常见种群为蜡状芽孢杆菌；上海的优势种群为蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌，常见种群为简单芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌；江西的优势种群为蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌，常见种群为简单芽孢杆菌、短小芽孢杆菌；四川的优势种群为蜡状芽孢杆菌，常见种群为简单芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌；少见种群为巨大芽孢杆菌；广东的优势种群为蜡状芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌，常见种群为巨大芽孢杆菌、球形芽孢杆菌；云南的优势种群为蜡状芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌、球形芽孢杆菌，常见种群为巨大芽孢杆菌、简单芽孢杆菌；海南的优势种群为蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌，常见种群为简单芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌黑色变种。

2、1我国芽孢杆菌种群的多样性

    从表11可以看出，15个分离到的采样点芽孢杆菌的丰富度在2-8之间。青海采样点的分离到的种群最少，只分离到2种，新疆、内蒙古和宁夏的芽孢杆菌丰富度最高，为8。陕西、四川和海南的丰富度为6，甘肃、江西、上海、广东、云南的物种丰富度为5，西藏的丰富度为3。15个采样点芽孢杆菌的多样性指数范围在0.2657-1.5586之间，西藏、内蒙古、陕西、青海、上海、四川芽孢杆菌的多样性指数在1.0000以下，其他采样点的多样性指数在1.0000以上，在1.0017-1.5586之间。新疆采样点的多样性指数最高，达1.5586，西藏采样点的多样性指数最低，仅为0.2657。均匀度指数在0.2419-0.9182之间，3个采样点的均匀度指数在0.5000-0.7000之间，4个采样点的均匀度指数在0.7000-0.8000之间，3个采样点在0.8000-1.0000之间，其中均匀度指数最高的是江西样点，最低的是西藏样点。生态优势度指数在0.2136-0.8199之间，最高的西藏样点，达0.8199，最低的是海南样点，只有0.2136。

从表11中可以看出，新疆样点的物种丰富度和多样性指数最高，其均匀度指数较高，生态优势度指数较低，西藏的物种丰富度较低，多样性指数和均匀度指数最低，生态优势度指数最高。生态优势度指数反映了各物种种群数量的变化情况，生态优势度指数越大，说明群落内物种数量分布越不均匀，优势种的地位越突出。说明物种多样性不仅与物种的丰富度有关，还可能与种群数量差异程度有一定的关系。

2、3芽孢杆菌的生态分布

巨大芽孢杆菌和简单芽孢杆菌在每个采集样点都能分离到，除青海外，每个样点也都能分离到蜡状芽孢杆菌。每个采集地的芽孢杆菌的多样性不一致，新疆样点的丰富度和多样性指数最高，生态优势度很低；西藏的物种丰富度较低，多样性指数最低，生态优势度指数最高。生态优势度指数反映了各物种种群数量的变化情况，生态优势度指数越大，说明群落内物种数量分布越不均匀，优势种的地位越突出。相同生境类型不同地理位置的生物多样性也不同。由此说明物种多样性不仅与物种的丰富度有关，还可能与种群数量的差异程度有一定关系。

    土壤是微生物生活的大本营，存在大量的芽孢杆菌，芽孢杆菌的种类直接反应土壤的生态状况。石春芝等对神农架自然保护区九大湖调查认为蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、环状芽孢杆菌和覃状芽孢杆菌是主要种类，巨大芽孢杆菌也有分离，但不是主要种类。张华勇等研究红壤不同生态条件下芽孢杆菌的变化情况中发现，巨大芽孢杆菌随耕作程度增加逐渐成为优势。本文采用的稀释平板法虽然不能全面反映采样地的实际情况，但可以反映芽孢杆菌在土壤中的存在情况。

四、主要菌株的分离与鉴定

（一）苏云金芽孢杆菌的分离与鉴定

苏云金芽孢杆菌（Bt）是一类革兰氏阳性、产芽孢、不同亚种可产生不同形状蛋白晶体的杆状细菌。其晶体蛋白已成为应用最成功、前景最好的生防农药。苏云金芽孢杆菌广泛分布于昆虫、土壤、仓贮尘埃、污水之中。基于土壤蕴含着丰富的微生物资源及地域多样性赋予了土壤中微生物种类多样性的特点，土壤成为筛选不同种类和基因型Bt原始菌株的最普遍、最直接的来源。自20世纪80年代以来，Bt分离方法力求快速、高效而不断改进并趋于成熟，全世界被分离出的Bt数量大大增加，种类增加。故鉴定Bt类别成为一项重要的基础性工作。

1、苏云金芽孢杆菌的分离

1、1温度筛选   与其他芽孢杆菌相同，苏云金芽孢杆菌的芽孢由外向内分为芽孢外壁、芽孢衣、皮层、芽孢内壁、原生质膜和原生质体。其中皮层的主要成分是肽聚糖，不含营养细胞所具有的多聚糖磷壁酸，所以皮层保持着芽孢的脱水状态和耐热性，另一方面，芽孢形成过程中，会产生大量DPA-Ca螯合物，使得芽孢中的生物大分子形成耐热凝胶，在80℃下热处理20min，苏云金芽孢杆菌芽孢也不会死亡。而且休眠的芽孢在75℃的亚致死温度下处理15min，活化效果最好，不但可促其快速萌发，还可提高芽孢的成活率。依据这一特性，可实施温度筛选。温度筛选分离范围广，不易漏筛，但工作量大，而且Bt要达到一定浓度。

1、2利用醋酸钠进行选择筛选   苏云金芽孢杆菌芽孢的萌发，直接受pH值影响：当pH值为7.0时，芽孢萌发率在85℃以上；当pH低于6.5或高于8.5时，芽孢萌发率极低。因此，加入适量醋酸盐的培养基可选择性地抑制Bt芽孢的萌发，经热处理而被杀死，从而消除干扰菌以达到高效分离筛选的目的。用该方法筛选Bt，可有效抑制蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的生长，使得菌落与Bt类似的干扰菌大大减少。

1、3弹土分离法   该方法简便，易操作。将土壤样品干燥后研碎，撒在灭菌的滤纸上，使滤纸面上均匀粘上一层样品粉末，使粘有样品的一面对着培养皿口，轻弹1~2次，然后培养。检出时，由于菌落种类多，数量大，影响目的菌落的特征识别；另外非目的菌落（芽孢菌菌落和真菌菌落）的存在，给纯化带来难度。

1、4抗生素选择性筛选   抗生素能纯化酶的活性，阻止微生物新陈代谢的某些环节，从而对微生物产生选择性作用。芽孢杆菌中，由于芽孢衣皮层致密、通透性差，抗生素不能进入芽孢内部，无法抑制其萌发和生长。不同种、属的芽孢对抗生素有不同的抗性。苏云金芽孢杆菌除与地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、日本甲虫芽孢杆菌抗性类似外，较其他常见芽孢杆菌抗性显著。抗生素筛选检出率高，效果显著，但由于苏云金芽孢杆菌各亚种之间对抗生素的敏感性不同，个别亚种会因抗生素浓度相对过高而不能形成芽孢和伴孢晶体，因此，抗生素筛选会造成个别亚种的漏筛。将醋酸钠、抗生素分离法合二为一，可显著消除干扰菌，使得土壤悬液的可操作浓度较单一使用醋酸钠或抗生素法高出20~30倍，大大提高Bt的分离效率和出土率。

2、苏云金芽孢杆菌的分类鉴定

    苏云金芽孢杆菌被归属为第12类第18群芽孢杆菌的一个种，种下还区分不同的亚种。随着苏云金芽孢杆菌新菌株的不断发现，各种分类方法也被相继提出：将苏云金芽孢杆菌分为不同的亚种、变种、血清学、晶体基因型。鉴定方法主要包括生理生化试验、酯酶法、晶体抗原法、鞭毛抗原法。

2、1生理生化鉴定   苏云金芽孢杆菌各亚种的生理生化特性存在着正与负、强与弱的不同。它们对一些反应会产生不同的阴性或阳性特征，将各指标综合起来，就构成亚种划分的标准。后来随着热解气相色谱法鉴定问世，由于烃类代谢的数量和种类不同，苏云金芽孢杆菌大多数亚种都能得到有明显差异的“指纹图”，热解气相色谱法鉴定苏云金芽孢杆菌省时、快速，为鉴定过渡到使用现代化技术展现了广阔的前景。

2、2血清型鉴定   苏云金芽孢杆菌的鞭毛主要由鞭毛蛋白质组成，它具有抗原的特性。在苏云金芽孢杆菌的鉴定中，血清型是一项重要的鉴定指标，这项指标特异性强，稳定可靠，被普遍接受和采用。1962年，Barjac对24个产晶体的品系进行生理生化和血清型研究，将Bt分列为6个血清型下的8个亚种。到2006年7月，Bt血清型已达到71个，血清型亚种达到94个。

3、苏云金芽孢杆菌cry基因的鉴定

随着生物化学、遗传学、分子生物学等学科的发展，1981年美国的Szhnepf和Whiteley克隆了苏云金芽孢杆菌的第一个cry基因（编码苏云金芽孢杆菌蛋白晶体的基因被称作cry基因），并于1985年发表了它的核酸序列。1989年该基因被命名为cryIAa，标志着Bt鉴定的研究进入了分子时代。1995年，Cricknore等在第28届国际无脊椎动物病理学年会上提出了新的cry基因命名原则，使得cry基因的分类趋于完善。现行分类系统根据δ-内毒素氨基酸序列的同源性确定出4个分类等级。

血清型等鉴定结果不能反映出Cry蛋白的类型，因此菌株命名与杀虫活性之间失去了联系的纽带，通常cry1、cry2、cry9编码蛋白对鳞翅目害虫有杀灭活性；cry1B、cry1I、cry3、cry7、cry8、cry18编码蛋白对鞘翅目害虫具有毒力；cyt1、cyt2、cry2、cry4、cry10、cry11、cry16、cry17、cry19、cry24、cry25、cry27、cry29、cry30、cry32、cry39、cry40编码毒杀双翅目害虫的蛋白；cry5、cry6、cry12、cry13、cry14、cry21编码蛋白可杀灭线虫。Cry基因的PCR扩增技术，不仅可以鉴别Bt菌株cry蛋白的杀虫特性，还能找到新型菌株，对于研究Bt资源的多样性，预测其杀虫活性具有重要意义。

3、1   PCR-RFLP鉴定   1996年台湾学者Kou和Chak创立了一种新的鉴定方法，即PCR-RFLP法，适用于对多种基因型的通用引物进行PCR扩增。用2种特异性内切酶消化扩增产物，根据不同的基因型会产生不同长度的酶切片段，经电泳分析，记录差异来断定菌株的基因型。目前，中国农科院植物保护所宋福平等进一步优化了cry2、cry3、cry4/10的通用引物，将鉴定级别提高到了cry基因的第3等级，并进一步将台湾学者鉴定的11种cry1/7/9基因型扩大到29种。Sauka等利用cry1I的PCR-RFLP鉴定体系成功对202株Bt菌株进行了鉴定。

3、2特异性PCR鉴定   特异性PCR鉴定是在PCR基础上建立的复合引物鉴定方法。其引物有通用引物和高度同源的特异性引物之分，如以色列等人用通用引物从菌株中鉴定出cry9基因后，又用特异性引物区分出cry9A、cry9B、cry9C、cry9D，并检测出一株推测应为cry9E的新菌株。这种方法用于鉴定已知基因是准确的、特异的，但对于新基因鉴定还需借助其他研究方法，并且特异性引物系统设计耗时、耗资金。

3、3杂交鉴定

3、3、1核酸分子杂交   不同cry基因可能会有45%的同源性，但在染色体上的保守区域中，同源性高达95%。因此，可设计保守区探针核和可变区探针来检测新的Bt基因。澳大利亚学者Beard等在用杂交方法鉴定cry新基因时，设计并使用了8个基因家族（10个不同cry基因）的通用探针，他们将实验分为2步，第1步用通用探针做Dot blot analyses，然后用特异性探针做Southern blot analysis，确定被检测出基因的基因型，再对比2步试验的结果，找出新型基因。但此方法首先要设计并合成大量DNA探针，并且较PCR鉴定耗时费力，新基因确定的类型仍然未知，需要借助其他方法作进一步鉴定。

3、3、2基因芯片   基因芯片的杂交可高效测定微生物中某一特定序列并进行全基因组水平检测，比较不同样品间mRNA转录及表达水平，从而揭示不同生长条件、发育阶段、药物处理情况下的基因表达。目前PCR-Based芯片技术和寡聚核苷酸探针设计也被应用于cry基因的鉴定。如刘旭光等建立了一种不经PCR扩增而直接应用寡聚核苷酸芯片从Bt总DNA中检测cry基因类型的方法，检测结果具有很高的可信度。应用寡聚核苷酸做探针，可大规模、高通量、真实地反映基因组中存在的功能基因，鉴定方法是适应基因组时代的强有力的技术之一。

4、cry蛋白鉴定   

对cry蛋白进行鉴定可最直接、最准确地获得Bt基因型，杀虫活力等相关信息，并可确定哪些基因被表达。Masson等研究蛋白时，用胰蛋白酶消化被测蛋白，用高效液相色谱对蛋白进行分析，在同标样相比较时，成功地分辨出cry1C、cry1D、cry1Ab的存在。但此法仅适用于对已知基因所表达的蛋白的鉴定。目前，对于cry蛋白测序而言，虽然真实性非其他方法所比拟，但由于存在许多技术性问题，如纯化、费用昂贵、步骤繁琐，较基因操作复杂等，还不具备应用条件，但它最具科学性，最具有发展前景。

（二）枯草芽孢杆菌的分离与初步鉴定

     枯草芽孢杆菌是一种短杆状、无荚膜、能运动的革兰氏阳性细菌，内生芽孢，其分布非常广泛，在土壤、湖泊、海洋、动植物体表等处皆能发现。枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，因其制剂是无毒、无残留、无污染的绿色添加剂，故具有广阔的发展前景，并在饲料添加剂、污水处理、生物农药、疫苗载体等各方面已经得到了广泛的应用，显示了巨大的社会效益和生态效益。试验自土壤中分离得到1株枯草芽孢杆菌，并对该菌株进行了鉴定，旨在为枯草芽孢杆菌基因功能的研究以及进一步开发利用奠定基础。

1、材料与方法

1、1试验样品   新鲜土壤，从山东省菏泽市某村田地土壤表层约10cm下采集的肥土。

1、2试剂   高保真Taq DNA聚合酶、各种限制性内切酶，pMD18-T载体，超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和细菌DNAout（G+），E.coli DH5α感受态细胞。

1、3样品的热处理   将采集的新鲜土壤加到营养肉汤培养基中，37℃培养18~24h，然后放于75~80℃水浴中热处理10~15min。

1、4细菌的分离   将热处理后的培养物用平板划线分离法涂布于普通琼脂平板上，37℃培养18~24h；选取生长良好的菌落反复接种，经数次琼脂培养基培养筛选，挑选在培养基上呈单个、灰白色、不规则、菌落边缘不整齐、表面粗糙的干燥型菌落镜检、观察并进行纯培养。

1、5细菌的鉴定   

1、5、1细菌的生化鉴定   根据《伯杰细菌鉴定手册》对分离细菌进行常规的生理生化鉴定。

1、5、2细菌的PCR鉴定    引物的设计与合成：根据GenBank中已发表的枯草芽孢杆菌16S rRNA基因序列应用Primer Premier 5.0软件自行设计合成了1对能扩增1154bp基因片段的引物，序列为P1   5’-CACTGG-GACTGAGACACGG-3’，P2   5’-GGCGGCTGGCTC-CTAAAA-3’。

    枯草芽孢杆菌基因组DNA的提取：挑取枯草芽孢杆菌单菌落接种到5mL营养肉汤中，37℃振荡培养过夜，参考细菌DNAout（G+）试剂盒说明书提取全基因组。

PCR体系与反应条件：以提取的枯草芽孢杆菌全基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增。反应体系（25uL）：DNA模板2uL，10×PCR Buffer 2.5uL，上、下游引物（25umol/L）各0.5uL，dNTP 2uL，Taq DNA聚合酶0.25uL，ddH2O17.25uL。优化的PCR反应条件：94℃ 5min，94℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 1min，共30个循环；72℃ 10min。PCR结束后，取5uL PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，观察结果。

目的片段的回收、纯化及序列测定：参照超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明回收纯化目的片段，然后将其与pMD18-T载体连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑斑，扩大培养，抽提重组质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定，将鉴定为阳性克隆的菌液测序。

16S rRNA基因序列分析：利用DNAStar软件对所测定基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行编辑，并与GenBank中的序列进行同源性比较。

2、结果

2、1细菌的形态特征

在普通营养琼脂平板上，菌落为圆形，边缘不规则，表面有皱褶，挑取单个菌落涂片，可见革兰阳性、直杆状细菌，常成对或呈链状排列，在营养条件贫乏或生长条件不利的情况下形成芽孢。

2、2生化特性鉴定结果

细菌的生化鉴定结果为接触酶反应阳性，利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇且产酸，利用柠檬酸盐，不利用丙酸盐，不形成吲哚，水解淀粉，可使明胶液化。

上述结果均符合枯草芽孢杆菌的生化特性，初步证明分离菌为枯草芽孢杆菌。

3、讨论

   （1）根据芽孢杆菌耐酸、耐盐、耐高温及耐挤压的特性，试验采用的75~80℃水浴中热处理10~15min的样品处理方式，从一定程度上简化了细菌分离的繁琐性，使分离细菌的操作简单化。

   （2）本试验从新鲜土壤中分离得到1株革兰阳性杆菌，其形态特征以及生理生化特征与文献报道的枯草芽孢杆菌的特性是一致的，但是由于细菌生理生化性状的可变性以及某些细菌生理生化特性的相似性，因此用常规的生理生化指标测定很难得到准确的鉴定结果。枯草芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌细菌形态特征及其生理生化特性及其相似，在伯杰氏细菌鉴定手册（1984年版）和国内其他参考文献中都没有查到这两类菌的明显的区别，因此从形态特征及其生理生化特性只能初步证实分离细菌为枯草芽孢杆菌。

   （3）为进一步证实分离得到的细菌为枯草芽孢杆菌，试验在生理生化鉴定的基础上又进一步做了分子生物学鉴定。16S rRNA基因序列分析在微生物种群分析方面应用广泛，已成为细菌分类和鉴定的一个有力工具。16S rRNA是核糖体小亚基的骨架，在结构上分为保守区、半保守和非保守区，保守区序列基本恒定，半保守区和非保守区序列因不同种、属细菌而异，一般不同属细菌16S rRNA基因同源性为70%~90%，而同种内不同株间基因同源性>99.5%。本试验扩增的16S rRNA基因序列与GenBank中的枯草芽孢杆菌16S rRNA基因的同源性达到99.6%，大于99.5%，进一步说明分离细菌为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌种。本试验分离的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌功能基因及其相关研究奠定了基础。